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色谱柱使用常见问题

更新时间:2023-05-17      点击次数:356
一、柱压升高


原因:缓冲盐使用不当导致缓冲盐析出,堵塞塞板和键合相颗粒之间的孔隙,阻碍流动相传质,引起柱压升高;

相同化合物的保留时间发生变化
原因:如果没有冲洗干净就进行进样,色谱柱内含有的盐会使化合物的保留时间发生变化;

二、柱效下降
原因:
1、有些缓冲盐会渗入到键合相的深处,损害硅胶基体,导致色谱柱键合相流失,柱床变松,柱效下降;
2、凝结在键合相表面,使C18碳链难以舒展,对物质的保留能力下降,导致柱效下降。因此用过缓冲盐后需要对色谱柱进行冲洗,水中缓冲盐浓度较大时应特别引起注意。

三、流动相中缓冲盐的正确使用方法
1、使用前的处理: 在使用缓冲盐作流动相之前需要用不含缓冲盐的流动相冲洗色谱柱,直至基线平稳。原则上,用于冲洗的流动相与分析时所用的流动相含水的比例相同(或含水更多),不同的只是用于冲洗用的流动相中不含缓冲盐。理由:缓冲盐通常易溶于水,难溶于有机溶剂。用含缓冲盐的(特别是做流动相的水为饱和的缓冲盐溶液时)流动相进行分析时,如果分析前色谱柱中用于保存色谱柱的流动相中含水的比例相对较小,不先冲洗掉,接下来做样品的时候所用的流动相中如果有机溶剂含量大,而其比例中所含的水又不足以溶解该缓冲盐时,缓冲盐将会在色谱柱柱体上析出,沉积下来,这将可能导致上述对色谱柱的损害。

2、使用后的处理:用与分析时含水比例相同的流动相(与分析用流动相的区别是,用于冲洗的流动相不含缓冲盐)进行冲洗约30min,直至基线平稳。如果该色谱柱在接下来很长的一段时间内不使用,要长期保存,则需再加上一步,即用纯的有机溶剂冲洗一遍,直至基线平稳。

四、使用缓冲液要注意几点
1、避免使用盐酸盐,盐酸盐对钢质有腐蚀作用。
2、缓冲液最好要现配现用,往往缓冲液是良好的菌类培养液,隔天或放置长时间实验时会有很多怪现象发生。
3、实验后不可用有机溶剂直接过度,有机溶剂会处使盐类析出,造成液路或色谱柱堵塞,可用95:5的水甲醇冲洗。
4、使用缓冲液要及时掌握ph范围,做到胸中有数。
5、清洗液路和柱子时,有温控可加热到30摄氏度易于冲洗。
6、长时间用缓冲溶液要注意观察接头处有无析出,若有白色盐类析出,可考虑一定周期用10%硝酸冲洗一下液路(拆下柱子,走30ml,再用5倍水冲洗)可以避免液路的堵塞。
7、选择缓冲液要用可靠的试剂,避免不纯的盐类造成不必要的麻烦。

如果流动相中有机溶剂的比例很高是不能用来冲洗缓冲盐的,是洗不出来的。通常C18柱先用5%~10%的甲醇冲洗,是可以把缓冲盐冲洗出来的,然后用纯的有机溶剂来保护柱子。解决方法是使用与流动相相同浓度不含盐的流动相进行清洗。但就是速度慢一些。用水是为了快速替换,一般在15分钟以内最好,且用0.8的流速较好. 如果用纯水冲,容易造成键合的碳链的流失,最好用5%~10%甲醇水溶液冲。可以用纯水代替流动相中的缓冲液,有机相不变。这样冲洗柱子比较稳妥。



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